12.7 微生物物种鉴定发展历史

微生物由于形态微小，数目众多，分类鉴定一直都是一大难题，传统的微生物鉴定方法，主要是根据微生物的表型特征，例如形态学、生理生化学，生态学等特征来推断微生物的系统发育。但是由于微生物形体微小、结构简单等特点，微生物的分类鉴定除了传统的分类方法之外，还必须寻找新的特征作为分类鉴定的依据。分子生物学的发展，使我们不仅可以根据表型特征，而且可以从分子水平上，通过研究和比较微生物乃至整个生物界的遗传型特征，甚至生物的基因组特征来研究生物的进化、发育和分类鉴定。

1 形态学特征

形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其中有两个重要的原因，一是它易于观察和比较，二是许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性。因此，形态学特征不仅是微生物鉴定的重要依据，而且也往往是系统发育相关性的一个标志，特别是对形态结构比较复杂的真核微生物和具有某些特殊形态结构细菌的分类鉴定尤为重要。常用于原核生物分类鉴定的形态学特征如表所示。但是形态学特征往往并不能有很好的效果，因为微生物很多形态特征相似的分类上可能相差很远，同一种内不同亚种之间也有可能形态特征差别很大，比如肺炎链球菌有的表面光滑能够产生夹馍，而有的却表面粗糙。过去根据表型特征归类在一起的属，有的现在根据系统发育分类已经被归类在不同的分类单元中了。

2 生理生化特征

生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。在以实用为主要目的表型分类中，大量原核生物的属和种，仅仅根据形态特征是难以区分和鉴别的，所以生理生化特征往往是这些医学上或其他应用领域中重要细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。例如得肠炎之后去医院要进行粪便化验就是这个道理，很多微生物快速鉴定系统就是通过鉴定微生物一系列的生理生化指标来对未知微生物进行鉴定的。但值得强调的是，由于不少生理生化特征是染色体外遗传因子表达的，例如质粒，加上影响生理生化特征表达的因素比较复杂，所以根据生理生化特征来判断亲缘关系进行系统分类时，必须与其他特征特别是基因型特征综合分析，否则就可能导致错误的结论。

3 血清分型

在病原微生物研究中，往往还采用血清学分型和噬菌体分型的方法。血清型分型就是利用已知抗体与抗原来进行血清学反应，例如凝集反应或者沉淀反应，酶联免疫等，血清学鉴定一般应用在种内不同菌株血清型的划分。比如我们常见的致病菌H亚型或者O亚型等，就是利用了血清型鉴定。

噬菌体分型是因为在原核生物中已经普遍发现有相应种类的噬菌体。噬菌体对宿主的感染和裂解作用具有高度的特异性，即 一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些细菌。所以，根据噬菌体的宿主范围可将细菌分为不同的噬菌型和利用噬菌体裂解作用的特异性进行细菌鉴定。

血清学试验和噬菌体分型具有很大的局限性，而且往往血清型上相近的样品在系统发育上差距很远。

4 DNA碱基组成

DNA碱基组成，也就是 DNA 中 GC比例。每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，他们应该具有相似的G+C含量，其实G+C含量固定，根据碱基互补配对原则，也就是ATCG碱基含量恒定。若不同生物之间G+C含量差别特别大表明他们关系远。每一个微生物种的 DNA 中 GC含量的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间， DNA 中 GC含量的数值不会差异太大，可以是某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 GC 含量范围。一般认为任何两种微生物在 GC 含量上的差别超过了 10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用 G+C 含量来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似。

5 DNA杂交

生物的遗传信息以碱基排列顺序线性的排列在DNA分子中，不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反应这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，他们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。DNA杂交有DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，核酸探针以及衍生而来的荧光原位杂交技术FISH等方法。

DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。因此；杂合率越高，表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，约有 70 ％。 核酸杂交鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别是当用常规方法难以鉴定或检测时，但是核酸杂交只能使用已知的序列，对于一个菌落中大量的微生物还是无法进行鉴定。

6 16S序列测序

无论是通过表型，生理生化特征，还是核酸杂交等，都不能很好解决微生物物种鉴定的问题。那么有没有一种合适的微生物鉴定方法呢。这种方法能够实现准确、快速、经济的鉴定出微生物；那么目前综合来看扩增子测序是比较好的解决方案。这里面我们所说的扩增子主要包括16S测序，18S测序和ITS测序等。平时说的16S测序，有时候是广义的概念，也包括18S，ITS测序等。一般在原核生物中，5SrRNA长度约120个碱基。16SrRNA约为1540个碱基，而23S rRNA约为2900个碱基。综合来看，5S太短，没有特别高的唯一性，而23S rRNA又太长，不容易进行测序。所以，16S rRNA被普遍认为是一把好的谱系分析的“分子尺”。这是因为，首先rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变，所以序列相对保守。

7 宏基因组序列测序

如果只提取其中的16S，利用16S来进行物种组成和丰度的鉴定，以及利用16S构建系统发育树。这样一次只能捕获原核生物的信息，如果要看真菌的组成情况就需要测序18S或者ITS，而病毒信息无法捕获到。而对整个样品基因组测序，则是将样品中所有的DNA信息都进行测序，包括里面所有物种的信息，16S和18S信息都包括在内，而且可以包括病毒的信息，不仅可以看样品中的物种组成及丰度，而且可以得到样品的基因集信息，通过基因分析，可以进行一些功能和代谢的分析，基因组可以分析的内容更多。但是很明显，宏基因组测序的数据量要远远大于16S测序，所以测序时间，效率以及数据分析难度上，要远远大于16S。如果只是想看一下样品的物种组成及丰度，也就是样品中有哪些微生物，则选择扩增子测序即可，而如果要关注样品中哪些重要基因起作用，则需要进行宏基因组的测序。